TÉCNICAS QUE SE REALIZAN EN LA UNIDAD DE PROTEÓMICA

Actualmente con el equipamiento disponible en la Unidad de proteómica podemos realizar:

1.      Electroforesis bidimensional (1ª y 2ª dimensión)

2.      Tinción de geles con

-        Azul Coomassie.

El Coomassie Brilliant Blue es un pigmento del tipo trifenilmetano aniónico, que se une de forma no covalente a los residuos de lisina de las proteínas. El límite de detección es 1mg de proteína por punto. Es compatible con la mayoría de métodos de análisis incluyendo MS y microsecuenciación Edman.

-        Plata: Hay dos métodos principales de tinción,

Nitrato de plata, el gel se impregna con nitrato de plata y se revela por reducción con formaldehído a pH básico, permite detectar entre 5-10 ng/punto y es compatible con MS siempre que no se utilice glutarahdehído.

Amoniaco de plata, más sensible, permite detectar < 1ng pero no es compatible con MS.

Las desventajas de la tinción con plata son el rango lineal limitado que poseen (menos de un orden de magnitud) y la dificultad de automatización de los protocolos.

-        Colorantes fluorescentes (p.ej Sypro® ruby)

Tinción después de la electroforesis por intercalado de fluoróforos en las micelas de SDS que rodean las proteínas o por interacción electrostática directa con las proteínas. Posen la ventaja de que no interfieren en el movimiento electroforético de las proteínas. Para geles 2D se utiliza SYPRO®Ruby. El proceso de tinción es sencillo y no implica muchos pasos como en la plata, lo cual hace posible su aplicación automatizada en estudios de alto rendimiento. Es un colorante muy fotoestable y puede detectarse con luz UV o con escáner con láser. Son protocolos compatibles con MS o secuenciación de Edman, con una sensibilidad intermedia entre la plata y Coomassie y su principal ventaja es el amplio rango dinámico que presentan, que los hace los más adecuados en los estudios cuantitativos.

3.- Cuantificación y análisis de los resultados

Una cuantificación precisa se basa en el análisis de una imagen digitalizada del gel teñido. En la mayoría de los casos las imágenes se obtienen por escaneo, cámara o fosforimager. A continuación el análisis asistido por ordenador de las imágenes incluye los siguientes pasos básicos

1.      Detección de puntos

2.      Cuantificación de los puntos

3.      Comparación entre los geles del patrón de puntos (matching)

En los últimos años se han desarrollado multitud de programas informáticos para analizar las imágenes de los geles, generalmente todos realizan los siguientes pasos: aplicar algoritmos para eliminar el ruido de fondo, los artefactos el gel, las rayas verticales u horizontales. Algoritmos que detectan y cuantifican los puntos y análisis estadísticos. Se pueden hacer múltiples comparaciones, agrupar los resultados, generar tablas…

Actualmente en la Unidad de proteómica utilizamos los programas ImageMaster 2D Platinum v5.0 (Amersham) y preferentemente PDQuest (BioRad).