INTRODUCCION

El proteoma celular es la totalidad de proteínas expresadas en una célula particular bajo condiciones medioambientales y etapa de desarrollo, (o ciclo celular) específicas. Es el complemento proteico del genoma.

La proteómica es el estudio del proteoma. El prerrequisito y a la vez el reto de un análisis del proteoma es la separación de proteínas de mezclas complejas con alta reproducibilidad y alta resolución.

La electroforesis bidimensional (2-DE) es una de las técnicas más utilizadas en proteómica de expresión. Tiene la capacidad de separar mezclas complejas de proteínas con una elevada resolución en patrones reproducibles y se pueden establecer diferencias cuantitativas y cualitativas en la composición de dos o más muestras. Se desarrolló por Patrick O´Farrell (Univ. Colorado 1975)

La 2-DE consta de una primera dimensión que es un isoelectroenfoque (IEF) y una segunda dimensión que es un SDS-PAGE (Electroforesis en gel desnaturalizante de poliacrilamida). Consigue la separación de mezclas complejas de proteínas en función de su punto isoeléctrico (pI), masa molecular (Pm), solubilidad y abundancia relativa.

Una característica importante es que proporciona un mapa de las proteínas intactas, lo cual refleja cambios en los niveles de expresión, isoformas o modificaciones post-traduccionales. También permite el aislamiento de proteínas para su posterior análisis por espectrometría de masas (MALDI-TOF MS, ESI-MS).

Los pasos en los que se estructura un experimento de 2-DE son:

1.      Preparación de la muestra y solubilización de las proteínas

2.      Separación de las proteínas por 2-DE

1.      Rehidratación de las tiras IPG (gradiente inmovilizado de pH)

2.      IEF

3.      Equilibrado de las tiras

4.      SDS-PAGE

3.      Detección de las proteínas y cuantificación (tinción).

4.      Análisis mediante programas informáticos de los patrones de expresión.

5.      Identificación de proteínas y caracterización (MS).

6.      Construcción de bases de datos de proteínas identificadas por 2-DE.

Tinción de geles

Después de la separación las proteínas deben ser detectadas en el gel, lo que implica que el patrón de puntos debe ser diferenciado del fondo. Se realiza normalmente en el gel de poliacrilamida o por unión de una molécula colorante a las proteínas.

Las características que se pretenden en un buen método de tinción son:

·         Alta sensibilidad

·         Amplio rango lineal para la cuantificación

·         Compatibilidad con las técnicas de MS MALDI y ESI.

·         Baja toxicidad y poco contaminantes.

Los métodos de detección de proteínas en geles 2D se dividen en cinco tipos principales:

1.      Colorantes aniónicos como el azul de Coomassie

2.      Tinción negativa con metales catiónicos, tinción de Zinc

3.      Tinción de plata

4.      Fluorescencia

5.       Isótopos radiactivos