MICROARRAYS

Protocolo de extracción de RNA de levadura con fenol. Este protocolo es un poco tedioso pero da RNA de buena calidad. Se puede emplear también kits comerciales.

Amplificación de RNA con kit Agilent. Podemos recurrir a la amplificación del RNA total cuando la cantidad de muestra de la que disponemos es muy pequeña por el motivo que sea, o bien cuando el RNA obtenido no tiene una calidad suficiente para conseguir los rendimientos de cDNA necesarios para seguir con el marcaje. Hay distintos kits comerciales, con el de Agilent, a partir de 50 ng de RNA total, se pueden obtener 200-1000 ng de cRNA (equivalente a mRNA).

Microarrays de RNA. Los microarrays se emplean para hacer estudios de expresión global, y comparar sobre un soporte sólido la expresión diferencial en dos muestras distintas, una control respecto a una tratada o dos tratamientos distintos. Para el marcaje fluorescente de las muestras de RNA, usamos el método indirecto. Este método requiere un paso de síntesis de cDNA a partir del RNA total o mRNA, en el cual se incorpora una proporción de uno de los nucleótidos modificado quimicamente con un grupo aminoalilo. En una segunda etapa, se produce una reacción química en la que el fluoróforo conjuga con el grupo aminoalilo del cDNA.

Protocolo de extracción de DNA genómico de levadura.

Microarrays de DNA. Los microarrays de DNA genómico se utilizan para detectar amplificaciones y deleciones en los cromosomas, para hacer comparación de genomas de especies próximas, o híbridos de especies...  En este caso para marcar fluorescentemente el DNA genómico, utilizamos un método directo, es decir se amplifica el DNA con random primers, enzima Klenow y una mezcla de dNTPs en la que hay una proporción de uno de los desoxinucleótidos marcado fluorescentemente.


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